在污水厂检出新冠病毒的遗传信号已经不是什么新鲜事，世界各地的污水厂都有类似的报道了。现在大家讨论的是：污水监测能否在未来成为评估一个地区新冠病毒传播趋势的实用指标？在公共卫生的决策者们看来，这些数据必须有可靠的重现性和可比性，而且是各地不同的污水厂和实验室得到的数据之间的重现性和可比性，不然这些数据的适用性永远停留在可能的阶段。
　　然而，目前世界上并没有统一的标准方法来测定污水中的新冠病毒。各地实验室的方法有没有优劣之分呢？美国的水研究基金会(WRF)从2020年7月开始就着手这方面的研究。这个项目还得到了比尔和梅琳达盖茨基金会的资助和支持。

　　图. 研究项目截图 | 图源：waterrf.org

　　这个项目的立项题目为Interlaboratory and Methods Assessment of the SARS-CoV-2 Genetic Signal in Wastewater。顾名思义，就是对不同实验室检测污水厂进水中的新冠病毒方法的可靠性进行比较评估。
　　项目主要考察了四个方面的问题：
　　哪种实验室方法最适合为SARS-CoV-2产生可靠的定量遗传信号？
　　实验室遵照质控操作重现样品结果的程度？
　　给定方法中，哪些步骤对准确性和精准性最为关键？
　　废水中SARS-CoV-2遗传信号的检测限及不同方法间的差异？
　　美国WRF委派了TRUSSELL TECHNOLOGIES公司来开展具体工作，他们在3个多月的时间里就得到了初步结果，并通过网络研讨会和业界分享了他们的研究成果，随后还将结果整理发表在在英国皇家化学学会(RSC)旗下期刊Environmental Science: Water Research & Technology上。
　　在2020年6月前，Trussell公司向全美60多个实验室发出参与邀请。经过筛选，他们最后选出了19个州的32个符合要求的实验室参与到这个项目中。因为其中有四个实验室对两种不同的方法进行了测试，所以这个项目一共考察了36种检测方法。
　　项目团队根据分析方法中的两大差异，将这36种方法分为了八大类。这两大差异是指：第一点在于是否去除样品中的固体，第二点是浓缩方法的差别，其中一共有四种情况，一种是不进行浓缩，另外三种分别采用超滤、过滤和聚乙二醇(PEG)等浓缩方法。

　　图. 分析方法的分类 | 图源：WRF

　　尽管每个实验室都有自己的SOP(标准操作程序)，但项目组会要求每个实验室都必须遵守由Trussell Technologies公司制定的一份长达202页的质量保证项目计划（QAPP-Quality Assurance Project Plan）。该文件写清了质量保证/质量控制（QA/QC）要求。这份QAPP的目的在于确保分析全流程的一致性，包括样品收集、运输、处理、分析方法的质量控制和数据管理等。QAPP的关键要素包括添加盲样、阳阴性对照，抑制对照、空白方法等。

　　图. 分析流程简介 | 图源：wrf

　　基质添加是实验的重要因素。对此，他们考察了两种标准样。虽然有一种基质的回收率高达100%，但因为另一种基质的回收率与SARS-Cov-2更接近（25%），所以项目组采用了这种基质，即人类冠状病毒OC43(betacoronavirus 1 (ATCC® VR-1558™))
　　采样地方方面，项目组选择了加州的两个污水厂进行采样，分别是Hyperion污水厂和Joint Water Pollution Control Plant。每个厂单独安排一天的采样时间。采样位置在沉砂池之后和初沉池之前。

　　图. 两个采样点的位置 | 图源：RSC

　　图. 在加州污水厂的采样现场 | 图源 ：WRF

　　每个实验室会处理10个样品，一般是5个来自污水厂A，5个来自污水厂B。但有8个实验室考察热巴氏杀菌的影响(60分钟的60°C)，这8个实验室则都分析10个来自同一个污水处理厂的样品，其中5个有加热，另外5个没有。

　调研结果
　　项目最后得到超过2000个数据点。他们主要得到以下结论：
　　这些不同实验室方法的比较显示了污水中的新冠病毒遗传信号的定量检测高度的重现性。在8组方法中，80％的结果差值在每升+/- 1log的基因组拷贝数之间（GC/L）。
　　数据显示浓缩方法的不同和是否去除固体对结果没有系统性影响。其他方法之间的差异，例如巴氏杀菌、引物组的选择和PCR平台的选择，造成的差异也不大。
　　严格的QA/QC要求、标准化的计划促进了实验室之间的结果重现性
　　多种方法都能得到高的灵敏度和检测限。

　　图. 不同方法的结果都在±1 log GC/L之间，体现良好的重现性 | 图源：RSC

　　基于这些结果，项目组认为对同一个地区来说，最重要的是坚持使用同一个实验室或者相同的SOP，这样才能确保结果的可靠性。这也意味着检测污水可以跟踪新冠病毒的传播趋势。
　　美国水研究基金会的首席执行官Peter Grevatt博士说：“我们很高兴与水业同行及时分享这项重要的研究成果。”他表示，这个调查项目的结果给各地区实验室提供了继急需的信息，帮助他们了解进行污水管网和污水厂的监控研究时需要的方法指南。
下一步计划
　　考虑到各地在方法选择上会受到当地实际情况的约束，所以目前实现全美的方法统一不现实。但项目也指出 ，各地的实验室依然有空间找到适合自身情况的“最佳”方法。其中的评判标准包括灵敏度、成本、操作员的经验水平、材料要求、通量(处理时间)等。这个项目会持续到今年年底，项目组会继续填补污水流行病学的知识空白，另外会继续鼓励不同方法和实验室之间的协作。
　　感兴趣的读者，可以通过以下网址下载该项目的质量保证计划（QAPP）：
　　https://www.waterrf.org/research/projects/interlaboratory-and-methods-assessment-sars-cov-2-genetic-signal-wastewater
　　这份文件非常详细介绍了用于规划、实施和评估质量保证和质量控制程序的政策和方法。如果您从事这方面的工作，应该非常值得一读。
　　IWA曾于今年4月份组织了关于 “污水种新冠病毒检测”（Detecting COVID-19 Variants in Wastewater）的网络研讨会，大家可访问IWA官网查看相关消息。

　　https://iwa-network.org/learn/detecting-covid-19-variants-in-wastewater/
　参考资料
　　https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.est.0c06191
　　https://www.nbcnews.com/think/opinion/covid-virus-spread-can-be-combatted-through-environmental-testing-why-ncna1256660
　　https://cwn-rce.ca/wp-content/uploads/Dec-1-2020-COVID-19-Wastewater-Coalition-Webinar-Phase-1-Inter-Laboratory-Study-Outcomes.pdf
　　https://www.waterrf.org/research/projects/interlaboratory-and-methods-assessment-sars-cov-2-genetic-signal-wastewater