翻译成文如下：
新兴研究者系列：城市水循环中大流行病毒的来源和归宿
最近发生的几起重大疫情，例如SARS，MERS（中东呼吸综合症），埃博拉病毒和禽流感，引起了人们对持续致命的病毒性大流行风险的关注。通常，由于这些包膜病毒在市政污水中的浓度较低，并且在水环境中极易降解，因此对污水和水行业的威胁不大。然而，许多临床报告表明，某些包膜病毒在感染过程中会从人粪便中排出。此外，生存能力研究表明，许多包膜病毒在水环境中能够存活数天至数月。本文中主要研究城市水循环中包膜病毒的潜在存在及其归宿，重点是冠状病毒（例如，SARS和MERS）和禽流感病毒。并且确定了一些不容忽视的问题，只有当供水和污水企业回答了这些问题，并向公众展示相关的事实，才能让公众确信灌溉水源、娱乐水源以及饮用水源是完全安全的。
引言
近年来，病毒爆发引发了人们对致死病毒大流行的高度关注。其中包括2003年的非典型性肺炎冠状病毒（SARS-CoV）、2012年中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）、分别在2003和2013年爆发的高致病性H5N1和H7N9禽流感病毒，以及2014年爆发的埃博拉病毒（见表1）。由于病毒大爆发是毁灭性的，所以其引发公众的恐慌在所难免。如1918年流感大流行时，两年导致5000万人丧生，全世界三分之一的人感染。尽管SARS，MERS，H5N1和H7N9禽流感以及埃博拉病毒的造成的感染和死亡人数的数量级低于人类大流行性流感的数量级（表1）。但科学家和公共卫生部门仍十分小心的监视着这些病毒是否有再次出现或是在人与人之间更易传播的迹象。
病毒引发的传染病每年都会出现或重新出现，尽管大多数不会像麻疹或人类季节性流感等常见病毒一样严重威胁公共卫生安全。在1980-2005这二十五年间，人类报告发现了约87种新的病原体，其中三分之二属于病毒。而RNA病毒(如SARS和H5N1流感病毒)在这些新发现的病毒中占比达到85%，其主要原因是单链的RNA病毒突变率很高。新发现或者重复出现的人类病毒通常具有动物宿主（称为人畜共患病），并且因为全球旅游、森林砍伐、工业化养殖、动物市场交易以及野生动物狩猎等活动的增加而加剧。未来几年，气候变化等因素也会使某些病毒传播范围更广。如果发生病毒大规模爆发，污水处理和饮用水处理作为一条潜在的传播途径，对其的监管也应有所加强（图1）。公用事业部门需要作出迅速反应，并且根据已经积累的现有证据做出决策来最大程度地降低职业和公共健康危害的风险。经过处理的污水作为休闲娱乐、灌溉用水以及饮用水的共同来源，尽管在处理过程已经大幅降低了病毒水平，但在污水处理厂的污水中，仍能检测到感染人体的病毒的存在。如果新型人类病毒通过被感染人群的粪便、尿液或者呕吐物扩散，则会进入市政污水处理系统并最终进入市政污水处理厂。2014年美国的埃博拉病毒病例就突显出缺乏关于人体废物和污水中新型病毒的存在和去向的数据。在这种情况下，政府部门表示，埃博拉病毒在人类宿主之外迅速失活，因此市政污水和已经处理过的污水中没有显著的职业和公共卫生风险。但当时对埃博拉病毒在人类宿主以外的存活能力的研究很少，也没有任何市政污水中埃博拉病毒存活率的研究。自那以后，对于环境中埃博拉病毒及其相关替代物的研究才开始出现，并发表与相关文献中。目前，关于埃博拉病毒在人宿主之外快速灭活的假设尚未得到验证。
对于城市水循环系统中病毒的研究，大多数都集中在肠道病毒这些较小的样本中。（即，这些病毒在胃肠道中复制并易于通过粪-口途径传播；表2）。肠道病毒颗粒由受蛋白质外壳（即，衣壳）保护的RNA或DNA基因组组成。并且肠道病毒具有抗热、抗酸、抗氧化等能力，因此可以在环境中存活较长时间。而包膜病毒（如流感病毒，冠状病毒和埃博拉病毒），还有一层由脂质和蛋白质组成的外壳。通常包膜病毒不会通过人类粪便等途径传播，并且在水环境中更易失活。然而最新污水病毒宏基因组的研究表明，污水中含有多种人类病毒，其中也包括一些包膜病毒。尽管污水中检测到病毒基因并不等于有活的病毒存在，但污水宏基因组学研究促使人们更审慎的对待水行业应对病毒爆发的应对策略，以及政府部门对并流行病爆发的应急机制。
本文通过对污水中新型病毒文献进行梳理，为污水处理和饮用水处理行业提供相关信息，并为将来病毒爆发时做好准备。根据世界卫生组织指引中对流感大流行的定义，即一种新病毒的出现，对导致人类严重的疾病，且很容易发生持续的人传人现象。相对而言，爆发事件是指特定区域的疾病水平升高到正常水平以上。冠状病毒和禽流感病毒这两类包膜病毒对于社区污水和饮用水安全尤为重要，因为已经确认这两类病毒存在于人的粪便中并且具备在水环境中存活的特征。冠状病毒包括导致SARS和MERS全球爆发的病毒，禽流感病毒通常会引发禽类病症，但偶尔也会传染给人导致严重的疾病。这些通常都是呼吸道病毒，但某些冠状病毒（例如SARS）和禽流感病毒可以通过粪便在水中传播，并且在近期爆发的疫情中呈现较高的致死率（表1）。如上所述，这些包膜病毒在结构上与肠道病毒不同，后者一直是水生病毒研究中的重点，因而被认为在水环境中有不同的特性。
图1.感染性病毒在城市水循环中的归宿以及潜在的人类暴露地点。A）粪便，尿液和呕吐物中排出的病毒进入污水系统。厕所冲水或室内管道系统出现问题都可能形成载有病毒的气溶胶，可能导致人体暴露。B）病毒通过市政污水系统输送到污水处理厂（WWTP）。维修污水系统的工人可能会接触感染性病毒。C）合流制污水溢流事件导致未经处理的污水中的感染性病毒释放到地表水中。D）进入市政污水处理厂的病毒要经过物理，生物和化学处理过程。污水处理厂的员工可能会接触未经处理和处理过的污水中存在的感染性病毒以及残留的污泥。E）污水可以将经过处理后残留的病毒携带到地表水中。F）通常通过土地填埋处理掉污水处理厂的残留污泥，工人或与污泥紧密接触的其他人可能会接触在污泥处理过程中幸存下来的感染性病毒。G）娱乐活动可能导致与地表水中存在的感染性病毒接触。H）污水管泄漏会导致地下水分配系统被污染。I）饮用水处理厂的进水中可能含有感染性病毒。水经过一系列物理和化学处理过程处理以去除污染物，包括病毒。J）市政饮用水使用者暴露于病毒中，这些病毒要么通过饮用水处理和分配来保持感染性，要么通过地下管道的泄漏进入分配系统。
污水中的潜在流行病毒
人类病毒不会在环境中增殖。因此，如果病毒通过城市水循环系统传播，必须借助人体体液进入水中，以保持其传染性，直到另一个人接触到被病毒污染的水体（图1）。通常，人们只研究肠道病毒在水环境中的存在和归宿，相关法规中也是如此。例如，美国环保署发布的地表水处理规范和地下水处理规范。除了普通的肠道病毒，污水中还含有大量的其他病毒。例如，在未处理的污泥和B类生物固体中，超过80%的样本中含有冠状病毒的基因，其次是风疹病毒基因。
人类病毒会随着感染者的粪便和尿液进入市政污水中，通过qPCR和培养等方法，已经可以定量测定市政污水中人类肠道病毒的浓度，据报道浓度达到每升水中含有109 个基因组序列（表 2）。而那些尚未进行研究但存在于污水中的病毒，有关它们存在于人类粪便和尿液的信息足以阐明其在水循环中可能具有重要的影响。粪便和尿液样本鲜少用于研究非肠道疾病，但呼吸道合胞病毒、人鼻病毒、冠状病毒和季节性流感病毒等均已经在粪便样本被检测出来。在大多数情况下，粪便中存在呼吸道病毒被认为是患者吞咽了携带病毒的鼻腔分泌物所引起的。不幸的是，PCR技术通常只用于检测人体样本的病毒，并不能传递传染性的信息。
要在城市水循环系统中引起足够的关注，污水中必须存在完整的可感染的病毒颗粒，而不仅仅是病毒基因组片段。实际上，已经从感染者的粪便或肠道样本中检测出了具有传染性的SARS-CoV和禽流感病毒颗粒。
流感病毒
流感病毒是具有节段的单链RNA包膜病毒，其能感染人类以及其他动物，如禽类和猪。上个世纪，流感病毒已引起四次人类大流行，包括1918年的H1N1西班牙流感大流行，1957-1958年的H2N2亚洲流感大流行，1968-1969年的H3N2香港流感大流行以及2009年 H1N1“猪流感”大流行。这些大流行是由于人类缺乏对新型病毒的免疫力而引起的。当动物流感病毒和人流感病毒杂交时会产生新型病毒，也可由动物病毒直接传染给人类（如：禽流感病毒）。
人流感病毒
季节性人类流感病毒不断在全球传播，导致季节性流行病。病毒在传播时会通过一种称为抗原漂移的现象缓慢变异。发病主要表现为呼吸道症状和发烧，偶尔也会出现胃肠道症状，特别是儿童。季节性流感通过飞沫、空气和接触等方式传播，三种传播方式相对重要性仍不清楚。至于人类季节性流感可能通过污水进行传播的问题，已在人类粪便样本,和市政污水中检测出病毒RNA。每克粪便中含量约为4.9× 103 to 8.0 × 107 PCR拷贝数，但这被质疑是由于患者吞咽了携带病毒的鼻腔分泌物，或病毒通过血液扩散到其他器官。正常的人肠道细胞中不存在流感病毒受体，因此病毒不太可能感染肠道细胞并在此增殖。根据现有文献中证据表明，即使在大规模爆发期间，市政污水中也不可能存在高浓度的人类季节性流感病毒。。
禽流感病毒
禽类中引起较小的疾病并且很少致命，而高致病性禽流感病毒在禽类中迅速传播并且具有很高的致死性。在极少数情况下，高致病性禽流感病毒可以传染给人类，通常是由于人类接触了大规模的家禽时。人类禽流感具有很高的致死率（表1），但近期尚未发生持续的人传人现象。令人深感担忧的是，如果未来禽流感传染给人后产生变异，可能会导致其更易人传人进而人群中大面积传播。这一假设性事件可能导致类似于20世纪西班牙流感大流行的一场致命的禽流感大流行。
与季节性人流感不同，高致病性禽流感病毒是通过粪便-口途径在鸟类中传播的，并与禽肠组织上的受体结合（即胃肠道感染）。2004年，当高致病性H5N1病毒从禽类传染给人类时，许多患者出现了严重的腹泻 ，粪便样本中发现了病毒，并且这些病毒感染人的肠道组织中并在此增殖。2013年，人类中出现的新型禽流感H7N9病毒的基因也频繁的在粪便样本中检测出。虽然尚未被确定为禽流感病毒，人类H1N1病毒也表现出异常高发胃肠道症状，在粪便中检出感染性病毒颗粒并且在肠道细胞中有效复制。
迄今为止，人类感染的禽流感病毒（如H5N1和H7N9）受限于其人传人的能力，没有造成大范围的影响。但公共卫生部门担心会出现新的变种，而新的变种容易在人与人之间传播。如果发生此类情况，人类没有对该病毒的免疫力，而开发出有效的疫苗需要时间。这很可能爆发疫情或大流行。届时，禽流感病毒将会进入市政污水，甚至病毒浓度可能很高。
冠状病毒
SARS-CoV于2003年在香港出现，并引起严重的下呼吸道疾病，死亡率高。在香港的一座公寓内，一共确诊319例病例，病毒借助雾化的粪便，通过公寓大楼中的通风管爆发和传播。尽管主要表现为呼吸系统疾病，但在感染者的粪便检测出了SARS-CoV RNA，不同人群的检出率在16%-97%之间。出现腹泻的患者检出率为23%-73%，特别是患病的第一周。
在发病后9至14天，粪便样本中的SARS-CoV RNA水平达到峰值，某一病例发病后长达73天内的粪便样本呈阳性反应。
粪便中检出SARS-CoV可能因为其能在小肠和大肠中进行增殖，已有小肠感染病毒的样本作可为证据。
除SARS-CoV，还有五种已知的人类冠状病毒。MERS-CoV于2012年出现于沙特阿拉伯，截止撰写本文时，已确诊1110位病例，并导致456人死亡。在一例患者的粪便和尿液中检测出了较低水平的MERS-CoV RNA（每毫克约103个基因拷贝），但在另外另个患者的样本中却未检测到。此外，人类冠状病毒HKU1（HKU1-CoV）RNA也在一些有胃肠症状的患者粪便样本中被检测出。在近期的污水宏基因组研究中HKU1-CoV从美国不同的污水处理厂污泥样本中检测出，虽然尚未用PCR的方法进行确认。不幸的是，HKU1病毒在粪便和污水样本中的传染性尚未可知。其余的三种人类冠状病毒（HCoVNL63, HCoV-OC43, andHCoV-229E）同样在粪便样本中检出但尚未确认它们对胃肠道感染有显著作用。基于现有数据，目前正在传播的人类冠状病毒对城市水循环系统造成重大威胁的可能性较低。话虽如此，如果未来出现像SARS-CoV这样高毒性的新型冠状病毒，仍可能对水和污水处理行业构成挑战。
在城市水循环中包膜病毒的归宿
城市水循环的主要组成部分包括饮用水供应，污水处理和雨水径流。粪便，尿液或呕吐物中排出的病毒通过人类生活污水进入城市水循环。因此，我们将讨论的重点放在城市水循环中污水和污水处理的包膜病毒归宿上，讨论中也包括包膜病毒在天然水和饮用水处理过程中归宿的非常有限的数据。
污水中的病毒浓度
在大流行的情况下，污水中的病毒浓度将取决于社区中被感染的人数和被感染者释放病毒的速度。关于污水中人类病毒滴度的大多数数据是基于肠病毒和qPCR测量值的（表2）。报告显示，污水进水中病毒浓度高达每升108–109个基因组拷贝数（gcL-1）。评估污水中感染性病毒颗粒浓度的研究相对较少，这可能是由于细胞培养技术有限和病毒提取方法的问题所致。
污水进水中的肠病毒，腺病毒和轮状病毒已经被监测，报告显示，病毒浓度通常低于104个每升噬菌斑形成单位（PFU）或感染单位（IU）。从粪便中释放的病毒倾向于处于聚集状态，并且病毒提取方法的回收率极低。因此，报告的PFU L-1值可能会大大低估了污水中感染性病毒颗粒的数量。
如果缺少污水中病毒数量的数据，则人类粪便或尿液样本中的病毒数量可能有助于预测病毒暴发期间污水中的病毒水平。正如预期的那样，与肠道疾病相关的病毒在人类粪便样本中的数量要高于与呼吸系统疾病相关的病毒。与暴发期间污水中高达109 gcL-1的浓度相比，人类粪便样品中的诺如病毒浓度可能高于1010 gcg-1,。人类多瘤病毒（JCPyV和BKPyV）在人尿中的浓度可超过1010gc L-1，在污水中浓度可达108 gc L-1。粪便中流感病毒的量可达到8.0×107 gc g-1，腹泻情况下SARS病毒在粪便中的量为107gc mL-1 ，尿液中为2.5×104gc mL-1。由于这些是报告中出现的最高水平，因此它们可用于预测污水中病毒在最坏情况下的浓度。
在城市污水中生存
要引起城市水循环系统的关注，通过粪便或尿液排泄的病毒必须能在污水中保持其感染性，指导其与人接触（图1）进入污水处理系统的人类废弃物通过复杂的地下管道系统输送到市政污水处理厂。尽管发达国家的城市环境中产生的大部分污水进入污水处理厂，但仍有一部分污水会渗漏入地下，在潮湿多雨天气下，未经处理的污水可能排放到地表水中。从漏损的管道释放到地下的未经处理污水可能会渗入饮用水输送管道，从而导致饮用水污染。未经处理的污水排放到地表水中会通过娱乐活动而导致暴露，并可能污染由地表水直接补给的地下水。
污水管网和污水处理厂的水力停留时间通常少于一天。在人体外，病毒对环境因素表现出多种敏感性，T90值（即90％的病毒被灭活所需的时间），范围从数分钟到数年不等（表3）。关于生存能力的数据仅源于体外培养、可以检测的病毒;不可培养病毒的生存能力通常是根据可感染的类似病毒的生存能力来预测的。通常认为带有脂质被膜的病毒在水性环境中容易丧失感染力。
据报道，诸如人类免疫缺陷病毒（HIV）在水环境中确实会迅速丧失其感染性，有报告中指出其室温下水中的T90值在1-2小时之间。对比肠溶性非包膜脊髓灰质炎病毒其室温下在水中T90值为56天。有趣的是，并非所有包膜病毒都会迅速丧失其感染性（表3）。例如，H5N1禽流感室温下在蒸馏水中的T90值约为100天，SARS-CoV室温下培养液中的T90值为9天。失活率高度依赖于水的温度和培养基质。温度越高，灭活率越高，盐度增加亦有相同效果。在两项人类冠状病毒水中的研究中发现温度对一系列变量的影响最大，在4°C和室温下，样品之间的衰减率差异最大。水中成分，例如蛋白质或微生物的存在，也会影响病毒的生存能力。例如，灭菌污水中的病毒灭活的速率与未灭菌污水中的病毒不同。
悬浮固体和有机物质的存在增加了肠病毒在水性环境中的生存能力。同样，冠状病毒在未过滤的初级出水的存活时间要比在过滤后的初级出流中的存活时间更长。77在有沉积物和有机物质的情况下，可以保护病毒免受化学和生物灭活剂的影响来提高其存活率。外来物质也可能导致其更快灭活，对比在巴氏杀菌沉淀污水和蒸馏水中的冠状病毒活性可知，并且不同的病毒和环境样品之间差异很大。
高度相似的菌株可能在不同的环境下稳定性不同（表3）。例如，在相同条件下，SARS-CoV在培养基中的感染力丧失速度远低于人类冠状病毒229E（表3）。同样，类似的禽流感病毒在相同的实验条件下，T90值的范围为58至171天。但敏感性差异的机理尚不清楚。病毒脂质膜可能起到一定作用，因为季节性流感病毒在不同类型的细胞中生长，其脂质膜的来源也不同，因此在水中的稳定性也不同。根据已有的生存能力数据，可以认为在人的粪便或尿液中排出的包膜病毒可以在水性环境中存活一段时间，这与污水和饮用水处理领域有关。当社区中的发病率很高且污水温度较低时，在污水处理厂的进水中感染病毒的浓度也可能会很高。
污水处理
总所周知，没有关于污水处理后包膜病毒归宿的报告。无包膜的人类病毒去除和灭活的程度取决于病毒的类型以及特定污水处理厂采用的处理工艺。肠道病毒，腺病毒和呼吸道肠道病毒在初级污水处理（即沉淀）中的去除率很低，报告称减少量低于1个数量级。在二级处理中，肠道病毒和腺病毒的去除更有效，报告称减少了1-4个数量级，但呼吸道肠道病毒减少量小于1个数量级。活性污泥中的去除依靠二级处理工艺中二沉池，池内固体吸附病毒，随后使其失活。最后的消毒步骤对于减少污水中的感染性病毒数量至关重要，但即使是经过消毒的污水也可能包含感染性病毒。通过对十座不同规模和处理工艺的处理厂的调查，搜集消毒之前的污水样本中发现，污水处理可使感染性肠病毒减少 0到2个数量级，感染性腺病毒减少2至>3个数量级。在另一项对五座污水处理厂的调研中发现，从进水到消毒出水，感染性病毒的对数去除率在1.9到5.0之间。每个污水处理厂除水中均监测到了感染性病毒。
在固相处理中，消化作用对非包膜病毒的影响各不相同，好氧消化比中温消化更有效。经过中温消化处理的B类污泥中，检测到感染性肠病毒和腺病毒频次较高。采用最大可能法（MPN）计算污泥中肠病毒和腺病毒的浓度分别在每克101-103和102-104个之间。与中温消化法和高温消化法相比，用热干化和堆肥法处理污泥可显着降低最终产物中的病毒水平。一旦施用于土地，吸附在污泥上的病毒就会渗出。也有证据表明，在土地施用过程中，污泥中的病毒被雾化，导致空气传播的巨大风险。应该再次强调，所有关于污水处理中病毒归宿的研究都集中在非包膜病毒上。
在自然水体中生存
感染性病毒经常通常随污水处理厂排放或合流制溢流而进入到地表水中。在地表水中，许多潜在因素会导致病毒失活，包括阳光，氧化物，微生物捕食等等。
由于自然水体可能是流感病毒的环境储存库，因此对自然水体中的包膜病毒的研究主要集中在禽流感病毒上。从康斯坦茨湖收集的地表水样品中，禽流感病毒在高于冰点的温度下生存时间在10-100天之间（表3）。此案例中样品并未暴露在阳光照射下。禽流感病毒在冰冻的自然水体样本中可以存活数月至数年。该病毒在pH7.4和8.2之间最稳定，在pH 6.5以下和pH10以上迅速失活。目前仍然缺乏阳光照射导致禽流感病毒失活的公开数据。
饮用水处理
对饮用水处理中包膜病毒归宿的研究表明目前仍然需要更多的实验。凝结-絮凝-沉降过程在去除H5N1流感病毒方面效果不佳或处理效果不够稳定。超滤可有效去除H5N1病毒，而噬菌体MS2是这个过程的有效替代品。通常，包膜病毒比非包膜病毒更容易被常见的饮用水消毒剂灭活。H5N1流感很容易被UV254灭活，在剂量为25mJ/cm2时即可达到高于5个数量级的灭活效果。而在相同剂量对肠病毒替代物的噬菌体MS2仅能达到低于2个数量级的灭活效果。低致病性H5N2流感是高致病性H5N1流感的一种替代品，也很容易被紫外线灭活。另一方面，SARS-CoV，在紫外线消毒的后仍然存在。氯消毒对水样中流感病毒的灭活效果良好。在室温下，一氯胺消毒后， H1N1和H5N1病毒达到4个数量级的灭活效果所需的一氯胺CT值（即消毒剂剂量和接触时间的乘积）低于60mg/(L·min) ；EPA建议为达到4个数量级的灭活效果，在20°C下一氯胺CT值应高于700 mg/(L·min)。目前仍然需要更多水质工程的实验数据，才能得出关于污水和饮用水处理过程中病毒归宿的主要结论。
检测水中的包膜病毒
缺乏成熟的检测方法阻碍了对水中包膜病毒的存在和归宿的研究。检测和定量环境样品中的病毒需要首先将样品中的病毒浓缩，以提高检测限。大多数可用方法都是针对非包膜肠病毒设计和优化的，尽管付出了很多努力，但仍没有共识性的浓缩方法。已发布的肠道病毒浓缩方法侧重于一系列过滤过程，超离心，不同pH值下的PEG沉淀，添加化学药剂，过滤器类型和离心机转速等要素组合起来。包膜 使病毒对有机溶剂，温度和pH更敏感；因此，许多用于非包膜肠病毒的提取和纯化方法对于包膜病毒不适用。例如，使用氯仿或氯化铯溶液的操作步骤会破坏脂质外层，因此应避免使用。采用正电过滤和氢氧化铝沉淀法从医院污水中仅回收了1.02％的SARS冠状病毒。相比之下，污水中非包膜病毒的回收率高达80％，尽管通常情况下回收率要低得多。作为从环境样品中优化包膜病毒回收率的少数尝试之一。Deboosere使用玻璃棉过滤和聚乙二醇（PEG）沉淀的方式，对湖水中的甲流病毒实现了8%的回收率。即使采用了纯化步骤，病毒浓缩物通常也包含会干扰检测方法的物质，但可以通过稀释或添加消除剂等物质将其降至最低。未来环境监测是否成功将取决于提取纯化技术发展与广泛应用。
样品浓缩物中的病毒通常通过基因法和培养法进行定性或定量检测。PCR法可检测病毒基因，目前最常用于检测环境和临床样品中的特定病毒。PCR法的流行主要由于其检测速度往往比培养法快得多，而且提供了物种和菌株特异性的鉴定，以及可以检测目前无法进行体外培养的病毒。PCR法的缺点是它们无法表征病毒感染力，而且需要开发合适的引物。因此，如果引物设计不当或病毒已在目标基因组区域发生突变，则可能无法检测到病毒。宏基因组方法旨在对样本中所有的病毒进行测序，目前越来越多地用于病毒检测和发现，并且无需事先对病毒有任何了解。粪便和环境样品中的RNA和DNA病毒都已完成测序。RNA病毒的测序方法是先用随机引物对RNA进行反转录，然后对cDNA进行测序。目前，由于高昂的样品成本，庞大的数据集和缺乏绝对定量分析，高通量测序不适于进行常规病毒检测。此外，由于样品中遗传物质的丰度高，对某些特定病毒而言宏基因组方法的检测限通常比PCR差。经过测序后，PCR法通常用于确认目标病毒的存在。应当指出的是，用于浓缩病毒并将其与其他有机体分离的方法会影响病毒宏基因组数据。
病毒培养方法（例如噬菌斑测定或细胞病变效应测定）由于能够表征病毒的感染状态，而在环境病毒学中继续发挥关键作用，而PCR或测序技术则无法实现。例如，需要关注环境或工程过程中人类病毒的归宿时，或者需要评估样品对人类健康构成的风险时，病毒培养仍然是唯一可靠的检测方法。不幸的是，许多重要的人类病毒无法进行体外培养，例如MERS-CoV。对于那些病毒，分子检测方法仍然是最佳且唯一的选择。
基于PCR和基于培养的方法均用于检测人或环境样品中的流感病毒。在PCR中，基质（M）基因通常作为目标基因，可同时检测所有流感亚型，而血凝素（HA），神经氨酸酶（NA）和其他基因作为目标基因，用于检测特定的流感亚型。甲型流感检测结果阳性，然后亚型特异性检测结果阴性，可以检测出潜在的新菌株。这种方法实现了对2009年H1N1型流感的鉴定。甲型流感病毒很容易在鸡胚蛋和多数细胞系，尤其是MDCK细胞系中培养和计数。在MDCK细胞中培养的病毒可以通过噬菌斑测定或50％组织培养物感染剂量（TCID50）进行计量。
采用PCR检测法，即使不是全部的冠状病毒，针对聚合酶基因保守区的引物也可以在检测限为5×101–5×103基因拷贝数的数量级下，检测出绝大多数的冠状病毒。简并引物也可用于检测多种冠状病毒。特定的冠状病毒引物以S糖蛋白或核衣壳蛋白基因为目标。由于人类冠状病毒有着不同的细胞嗜性，因此无法在相同类型的细胞系统中进行培养。例如，SARS-CoV和HCoV- NL63可以在常见的细胞系中轻松培养，例如CaCO-2（SARS）和LLC-MK2（HCoV-NL63）。HCoV-229E和HCoV-OC43虽然也能够进行体外培养，但是条件要求更加苛刻，且可供进行复制的宿主范围更小。剩余的两种已知的人类冠状病毒HCoV-HKU1和MERS-CoV，不容易在现有的细胞系中培养。因此，它们在环境样品中的传染性和最终归宿无法轻易测定。
结论
目前，关于城市水循环在包膜病毒（尤其是禽流感病毒和冠状病毒）传播中的潜在作用方面存在大量知识空白。为了解决此问题，我们建议环境工程师，病毒学家和公共卫生研究人员共同努力进行以下研究：
(1)需要开发和优化从复杂的样品基质（如废水，残留的生物固体和地表水）中提取和纯化包膜病毒的方法。在测试过程中，应在样品中掺入一系列包膜病毒以及肠道病毒或肠道病毒替代品，以更好地了解提取回收率如何随病毒的物理特性而变化。
(2)研究应解决在水环境中包膜病毒生存能力的变异性。例如，禽流感病毒株的哪些结构特征使其比其他包膜病毒在水中保持更长时间的感染性？
(3)研究应针对在废水和饮用水处理过程中的存在和归宿，以及包膜病毒何时通过废水排放或向土地施用生物质而释放到环境中的。只要有可能，这些方法都应针对可进行体外培养的病毒，以便报告基因拷贝浓度以及病毒感染浓度。
(4)应将更多研究集中在高致病性病毒（如禽流感病毒株）的环境归宿上。如表3中的数据所示，相似的病毒可能表现出截然不同的生存能力特征，替代物可能无法准确预测高致病性病毒的环境归宿。此类研究需要在BSL3及BSL4级别的实验室中进行。由于大多数环境病毒学家无法进入此级别的实验室或没有接受过此级别的生物安全性培训，因此未来需要更加广泛的协作。
(5)应对废水，娱乐用水和饮用水中的高致病性包膜病毒进行定量的风险评估。
这些研究问题对于环境工程和公共卫生应对进入城市水循环并可能造成致命性爆发或大流行的包膜病毒而言至关重要。