过去十年，我们看到越来越多由于抗生素耐药性导致病人“无药可治”的报道。数据显示，在2007-2015年间，欧洲每年因为感染抗生物耐药性病原体死亡人数从1.1万升至2.7万。水生环境在传播抗药性方面起着潜在的重要作用。
污水处理厂是维持城市卫生健康的重要基础设施，但由于大部分的污水厂在设计阶段没有考虑抗生素耐药性的问题，所以这些抗生素耐药性基因(ARGs)会和污水厂的出水一起排入河道等水体。那么这些ARGs最后的去向是如何的呢？
瑞士EAWAG和苏黎世联邦理工学院(ETH)等机构联合对瑞士的两条河流进行了考察，他们的调研结果发表在IWA期刊《Water Research》上。
视频：EAWAG研究团队去野外河流采样的情景
考察地点概况
Suze河和Murg河是这次研究考察的河流，因为他们满足三个预定条件：
1.最高的废水排放/河流流量比；
2.最少的侧流(减少侧流稀释作用)；
3.直接接收河流到下游下一个污水厂的距离最长。
两条河流的地理分布如下图所示：
图：SUZE河的采样点——沿河的采样点分布图（上）第一个污水厂出水口上游的采样点（下）
图：Murg河的采样点，其中S5是Münchwilen污水厂的采样点
图：Münchwilen污水厂的采样口位置，它有一个侧流，和污水厂出水比约2:8.
他们的采样条件也有所讲究，例如要在非雨天进行采样，要保证采样前36h内采样点没有降雨发生。在低流速的情况下，采样深度一般小于30cm (两个地方的年流速中位数为2.03和1.63m³/s)。具体三个采样点分为河断面的中间位置以及河两岸到中线的中间点位置。现场测量参数包括温度T、溶解氧DO、电导率、pH值等，水样装入5L的消毒瓶后于4°C避光保存(有机微污染物的样品在-20℃下存放)，随后送至实验室，并在36h内进行处理及后续分析。
Suze河的研究范围长达23.7km，其中包括污水厂出水口上游10km的河段，下游则设置了8个采样点(从0.5km到13.7km)。他们在2018年进行了4次集中采样，时间为7月(3次)和11月(1次)。
Murg河的研究范围为7km，其中有200m的上游区和6.8km的下游区，在下游也设置了8个采样点(从0.5km到6.8k m)。他们在此进行了3次采样，时间为2018年7月（1次）和8月(2次)。
考察内容
他们考察的内容包括抗生物耐药性微生物的数量、16S rRNA基因扩增子测序数据、化学指标分析(金属、离子、溶解性有机碳、溶解性微污染物)、下游稀释作用的影响。
其中，根据此前的使用方法和实验室标准协会给出的耐药极限，他们用两种抗生素的组合来考察抗生物耐药性微生物的水平(R2A琼脂平板培养)，这两种组合分别为：
1.克拉霉素（4.0 mg/L）和四环素（16.0 mg/L）（CLR/TET）
2.磺胺甲恶唑（76.0 mg/L），甲氧苄啶（4.0 mg/L）和四环素（16.0 mg/L）（SMX/TMP/TET），指临床和实验室标准协会给出的肠杆菌科耐药极限，也是我们以前的研究对象之一。
在稀释作用方面，他们使用钠离子和4 / 5-甲基苯并三唑，卡马西平两种微污染物作为保守跟踪物。原因是这些物质在出水口的浓度远高于上游点，而且不会在河流系统中降解或被吸附。在这个基础上，他们建立了一套稀释参数的计算方法：
图：在物料平衡假设下，用某污染物的浓度作为标记，得到从上游点A到下游点B的稀释参数（DP）
污水厂上游及出水口水质
分析结果显示，污水厂上游的I型整合子和目标ARGs的水平都较低，但在Murg河，ermB和I型整合子的水平有所上升。
两条河上游的大部分微污染物都在检测限以下，但ARG培养结果则显示，可能有来自城市或农业活动的间歇性干扰，但研究团队表示这些异常点需要进一步的实验来找出原因。
图：qPCR得到的污水排放点上下游河水中sul1和intI1的水平（基因拷贝/ mL）
图：ARG指示基因的异养菌数培养结果(左边为Suze河，右边为Murg河，上半部为CLR/TET组合，下半部为SMX/TET/TMP组合的结果)
下游ARG的短程去向
从上图可以看出，污水厂出水会带入相当数量的污染物。其中出水的钠浓度高出上游1个数量级，ARG和intl1的水平高出1-2个数量级，微污染物则高出超过2个数量级。
另外，为了更广泛地了解河流抗生素抗药性组，他们对部分样品获得的元基因组的ARG含量进行了检测。他们一共得到了65个ARG的子类型，其中49个在上下游样品中也有测出。毫无疑问，最靠近出水口的采样点的抗药性组会受到污水厂出水水质的影响。
但是，这些抗生素抗性指示基因的水平在出水口下游2-2.5km的位置很快就降到和上游一样的水平。研究团队指出这背后有包括来自地下水或支流的稀释水、阳光暴晒或低温导致细胞死亡，又或者是细胞沉淀这几种可能的原因。
哪个是主要的原因呢？稀释参数的分析显示，稀释作用是最主要的原因。因此他们指出在研究ARG的时候，要仔细考虑稀释作用的影响，要以总的排放量而不是浓度作为下游的评估依据。
Murg河的异常结果
Murg河下游5.0-6.8km区间内观察到sul1 和intI1的升高，他们尝试对此进行解释。他们首先测定了含有sul1的contigs(重叠群)。Sul1基因有高度的活动性，而且常常和intl1有关。实际上，所有样品中与intI1相关的sul1的contigs都是单一类型的同源物；而且因为它含有与质粒相关的基因(parA)，因此可能和质粒有关。
研究团队表示，在这次试验里，他们无法从这些序列信息得到有意义的分类，因此无法确定Murg下游出现的增量是来自污水厂出水中的生物体还是下游环境生物本身的贡献，抑或是采样点附近的本地污染源。他们认为在之后的研究中，可以尝试通过分离或构建基因组来获得更多信息。
除了生物方法，研究团队还尝试用化学指示因子来研究是否存在本地污染源或非点源污染。他们先研究一些在瑞士出现的微污染物作为潜在指示物的可能性，包括用于养猪的磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine或sulfadimidine），以及用作除草剂的mecoprop(2-甲-4-氯丙酸)。
他们认为，如果有足够的农业或城市地表径流，可能会携带该地区潜在的抗性基因和细菌，导致污水厂下游区域这些污染物浓度水平的增加或持续偏高。在Suze河中，除一个上游的样品之外，所有样品中的磺胺二甲嘧啶均低于检出限（LOD约0.8 ng/L）；而在Murg河中，第三次的采样数据显示，污水厂似乎是磺胺二甲嘧啶的来源之一，然而，在下游的位置又未观察到该化合物的增加。因此，他们对第三次的样品进行了进一步考察，以评估水体原位抗性选择的潜力。磺胺甲恶唑（Sulfamethoxazole）及其衍生物是所检出的抗生素中浓度最高的一个（33-95ng/L），但依然远低于预测无效应浓度(PNEC)的标准浓度(16000ng/L)。而常与磺胺甲恶唑搭配的抗生素甲氧苄啶(trimethoprim)的测出浓度值也远低于PNEC标准值。他们还注意到两条河的河水停留时间都相当的短，分别为51.4和49.5min/km，他们认为这样的流速使原位抗性选择的可能性变得更不合理。
尽管无法为Murg河的异常数据找到合理的解释，他们认为观察结果清楚地表明，ARGs的增加有可能不是人为污染产生的。他们指出，由于目前sul1和intI1是常用的监测人为耐药性来源的跟踪基因，因此，他们提醒同行，日后在制定监测方案的时候，应该采用多目标的方法以增强监测的稳固性。
小结
虽然在部分异常数据上作者们暂时无法给出合理地解释，但无论如何，他们这次研究还是得到了一些积极的新发现，例如一些很有希望作为日后监测人为耐药性来源的靶标基因。这些工具应该会在公共卫生方面发挥更大的作用。
早在2001年，瑞士就推出了全国性的“国家抗药性研究计划”（NRP 49）。这个五年计划旨在建立适用于前瞻性耐药性监测系统的科学策略和新方法，并对瑞士所有相关领域中有关耐药性的现状进行调查，包括人类以及动物种群、农业、食品和环境等方面。这次研究是在时隔10年之后，于2016年启动的一次新的全国性研究（NRP 72），目标已经变为降低抗菌素耐药性，并减少其对传染病治疗的负面影响。两个研究项目的总资金分别为1200万和2000万瑞士法郎。想了解该项目更多详情的读者，可以查阅他们的官网：http://www.nfp72.ch/en
图：NRP72计划时间表
环境ARGs研究一直是IWA的关注焦点，对这方面感兴趣的同行，也可以浏览香港大学张彤教授团队在去年的《Water Research》发表的相关综述文章，题目为《Source tracking of antibiotic resistance genes in the environment — Challenges, progress, and prospects》。
参考资料
https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0043135421002487
https://link.springer.com/article/10.1007/s00253-008-1829-z
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0043135420306643